受理号：CSZ1700127体外诊断试剂产品注册技术审评报告产品中⽂名称：⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）产品管理类别：三类6840
申请⼈名称：厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司国家⾷品药品监督管理总局医疗器械技术审评中⼼⽬录基本信息 (3)⼀、申请⼈名称 (3)⼆、申请⼈住所 (3)三、⽣产地址 (3)产品审评摘要 (4)⼀、产品概述 (4)⼆、临床前研究摘要 (7)三、临床评价摘要 (15)四、收益-风险评估 (24)综合评价意见 (28)基本信息⼀、申请⼈名称
厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司⼆、申请⼈住所厦门市海沧区⿍⼭路39号三、⽣产地址
厦门市海沧区⿍⼭路39号产品审评摘要⼀、产品概述
（⼀）产品主要组成成分表1 试剂盒主要组成成分
试剂盒具体组成成分、配套试剂及软件见说明书。（⼆）产品预期⽤途
本试剂盒⽤于定性检测⾮⼩细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）患者经中性福尔马林固定的⽯蜡包埋（FFPE）的组织样本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HE R2/MET基因变异。其中，针对NSCLC，EGFR基因中：19号外显⼦缺失（19del）、L858R点突变⽤于吉⾮替尼⽚的伴随诊断检测，T790M点突变⽤于甲磺酸奥希替尼⽚的伴随诊断检测；AL K基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）⽤于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测；针对CRC，KRAS基因野⽣型⽤于西妥昔单抗注射液的伴随诊断检测；如表2所⽰。
表2 伴随诊断⽤途的基因变异类型及相应的靶向药物
表3中为本试剂盒可以检出，但未经伴随诊断验证的基因变异类型。表3 未经伴随诊断⽤途验证的基因变异类型
其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯⼀依据。临床医⽣应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对检测结果进⾏综合判断。（三）产品包装规格24测试/盒
（四）产品检验原理
本试剂盒通过构建样本DNA测序⽂库，并使⽤特异探针对⽂库进⾏⽬标区域捕获富集，捕获后的⽂库通过⾼通量测序，可实现多个基因多个突变的⼀次性检测。
⾸先，以FFPE样本提取的DNA为材料，进⾏DNA⽚段化处理，并使⽤磁珠对DNA进⾏⽚段选择，然后对所得⽚段进⾏末端修复和加A处理，使⽤DNA连接酶将接头连接到DNA模板的两端，再使⽤带有标签序列（Index）的引物和聚合酶进⾏PCR 扩增得到扩增⽂库；扩增⽂库与带有⽣物素标记的寡核苷酸探针进⾏液相杂交，并⽤链霉素包被的磁珠对与探针结合的⽂库进⾏捕获富集，最后经过PCR扩增得到捕获⽂库。捕获⽂库采⽤基因测序仪（型号：NextSeq CN500，杭州贝瑞和康基因诊断技术有限公司⽣产，注册证号：国械注准20153400460）进⾏⾼
通量测序。对于测序数据，采⽤⽣物信息学软件判读10种基因中是否存在来⾃肿瘤的变异。⼆、临床前研究摘要（⼀）主要原材料1.主要原材料的选择
该试剂盒主要原材料包括：捕获探针、末端修复酶、连接酶、DNA聚合酶、对照品等，这些原材料均为外购⽅式获得，捕获探针为申请⼈⾃⾏设计后由专业的合成公司合成。申请⼈选择有资质的供应商提供的原料，通过功能性试验，筛选出最佳原材料和供应商。制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。2. 企业参考品和质控品设置情况
企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、检测限参考品和重复性(精密度)参考品。其中：
阳性参考品共18份，包括该产品可检出的所有突变或融合类型，均为DNA样本。其中8份来⾃临床样本，5份来⾃混合的细胞系参考品（由⾃⾏购买的不同突变或融合类型的15个细胞系参考品混合⽽成），5份来⾃混合⼈⼯合成DNA的⼈类细胞系参考品（⼀共含18个不同突变或融合类型）。所有参考品均⽤Sanger测序法和数字PCR⽅法验证。
阴性参考品共8份，包括1份⼤肠杆菌样本，7份试剂检测范围内基因变异阴性的临床样本。所有样本均⽤Sanger测序法和数字PCR⽅法验证为相关突变阴性。
检测限参考品共10份，包括该产品可检出的所有突变或融合类型。其中5份由混合阳性细胞系和试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系DNA稀释获得，5份由⼈⼯合成DNA和试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA稀释获得。10份检测限参考品稀释后的突变类型和重排（融合）类型变异⽐例为1%。
重复性参考品总共15份，包括该产品可检出的所有突变或融合类型。其中7份由混合阳性细胞系和试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系DNA稀释获得，7份由⼈⼯合成DNA和试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA稀释获得，1份为试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系样本DNA。12份弱阳性参考品突变⽐例为1～5%，2份强阳性参考品突变⽐例为15%，另采⽤试剂检测范围内基因变异阴性的细胞系制成1份阴性参考品。
该产品的对照品来源于细胞系样本的DNA，其中阳性对照品包含EGFR/KRAS基因突变阳性和ROS1基因融合，阴性对照品为试剂检测范围内10种基因变异阴性，⽤于检测过程中试剂和仪器的质量控制。（⼆）⽣产⼯艺及反应体系研究
申请⼈通过对试剂主要⽣产⼯艺的研究，确定了最佳⽣产⼯艺。
申请⼈通过使⽤初步确定的配⽅进⾏反应体系配制，对反应体系中的样本核酸提取试剂、末端修复试剂⽤量、连接试剂⽤量、接头⽤量、LC-D7/D5引物⽤量、杂交⽂库混合数量、杂交捕获⽂库⽤量、封闭剂⽤量、捕获探针⽤量、杂交液⽤量、磁珠⽤量、杂交时间、扩增反应条件等进⾏筛选和优化，通过功能性试验，最终确定了最佳的反应体系。（三）分析性能评估
分析性能评估内容包括阴/阳性参考品符合率、最低检出限、分析特异性和⼲扰物质、重复性、肿瘤组织样本要求研究、核酸提取纯化配套试剂组合性能研究等。
在阴/阳性参考品符合率试验中，申请⼈采⽤18份阳性参考品和8份阴性参考品对3批成品试剂盒（P215071301Z、
P215071501Z、P215071701Z）进⾏了检测验证，检测结果均为预期的突变型，说明阳性参考品符合率和阴性参考品符合率均为100%。同时选取21个阳性临床样本在3批成品试剂盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）上分别进⾏检测，结果均能正确检出。
在最低检出限试验中，申请⼈采⽤10份检测限参考品对3批成品试剂盒（P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z）进⾏了检测验证，结果均能正确检出。同时选取4份经过数字PCR 定量的阳性临床样本（EGFR/ALK/HER2基因变异阳性，含有点突变、插⼊缺失突变和基因重排），⽤基因变异阴性的临床样本配制8级突变频率梯度共32个样本，每个样本分别在3种建库起始量（10 ng、30 ng和50 ng）下进⾏了6次重复检测，确定了样本的检测限为可检测30ng DNA中频率低⾄1%的突变（含有点突变、插⼊缺失突变和基因重排）。
取15份经过数字PCR定量的阳性临床样本（EGFR/ALK/ROS1/HER2/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因变异阳性，含有点突变、插⼊缺失突变和基因重排），⽤试剂检测范围内基因变异阴性的临床样本配制成1%变异频率，在30ng建库起始量下，⽤3批成品试剂盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）对各样本进⾏了20次重复检测验证，最终确定该产品不低于95%检出率时，可检测30ng DNA 中频率低⾄1%的突变（含有点突变、插⼊缺失突变和基因重排）。在分析特异性试验中，申请⼈采⽤试剂盒检测范围内的基因变异阴性的临床样本DNA，进⾏不同建库起始量的检测，检测结果均为阴性，说明产品对不同起始量的阴性临床样本DNA 具有良好的耐受性。对于试剂盒检测范围内的基因变异阳性参考品，本试剂盒检测结果均为相应型别阳性，没有错检或漏检，说明本试剂盒能准确检测⽬标区域的碱基突变状态，检测的变异类型间不存在交叉反应。本试剂盒能对⾮⼈类基因组（⼤肠杆菌和肺炎链球菌）DNA进⾏正常建库，但不能对⽬标区域序列进⾏捕获富集，说明本试剂盒与⾮⼈类基因组DNA⽆交叉反应。
在⼲扰物质试验中，申请⼈在阳性临床样本和阴性临床样本中分别加⼊如下⼲扰物质：坏死组织（等体积）、⼄醇（21.7mmol/L）、⼆甲苯（35 mmol/L）、蛋⽩酶K（0.08 mg/mL）然后进⾏检测，样本检测结果均与预期⼀致，说明这些⼲扰物质在不⾼于上述浓度的情况下不会对该产品的结果产⽣影响。
在重复性试验中，申请⼈采⽤重复性参考品15份在3批成品试剂盒（P215071301Z、P215071501Z、P215071701Z）上分别完成20次重复检测，检测结果⼀致。同时选取了21份临床样本，在3批成品试剂盒（06018010501Z、06018032901Z、06018052101Z）上分别完成20次重复检测，检测结果⼀致。
针对核酸提取纯化步骤，申请⼈采⽤临床样本，平⾏⽐较了2种核酸提取试剂盒的提取效果，根据与该产品的组合性能研究结果，确定了1种核酸提取试剂作为样本提取的推荐试剂盒。
在肿瘤组织细胞含量研究中，申请⼈对不同肿瘤细胞占⽐对检测结果的影响进⾏了研究。结果表明，肿瘤细胞占⽐5%以上的组织样本均可检出。结合临床样本的多样性和复杂性，建议组织样本肿瘤细胞占⽐≥20%。
申请⼈提供了3批产品（06216070401X，06216071101X，06216071801X）在其适⽤机型上的性能评估资料，结果均符合要求。
（四）阳性判断值
申请⼈⾸先采⽤少量临床样本进⾏了初步确定，然后采⽤不同基因不同变异类型的阳性临床样本进⾏阳性判断值验证，最终确定了阳性判断值标准。
申请⼈共采⽤了38个样本（16个商业化参考品及22个临床样本；包含了点突变、插⼊/缺失和融合三种类型）进⾏检测，分别统计其检出情况。通过ROC曲线⽅式确认采⽤突变频率0.4%可以有效检出突变。并对样本原始数据分别随机抽取测序深度为15000×、10000×、7500×、5000×，确定样品测序平均原始深度要求为10000×，并确定了位点有效深度的最低要求为500×，突变绝对拷贝数应不低于2，选择链平衡性0.1～0.9作为阳性判断值的要求（融合不适⽤）。
阳性判断值验证：采⽤10份阴性、10份灵敏度参考品、以及经数字PCR验证并稀释⾄1%的15例FFPE样本（包含不同基因不同区段的变异类型），分别测试阳性符合率、阴性符合率，结果表明，阳性符合率、阴性符合率都100%吻合，总体验证结果符合要求。
通过上述实验，最终确定该产品使⽤配套软件进⾏数据分析时的阳性判断值为：1.突变⽐例不低于0.4%；2.测序有效深度不低于500×；3.突变绝对拷贝数不低于2；
4.链平衡性介于0.1～0.9之间（融合不适⽤）。（五）稳定性研究
申请⼈对该产品实时稳定性、运输稳定性、冻融稳定性、开瓶稳定性进⾏了研究，确定了在各种条件下本产品的有效保存时间。同时对⽯蜡样本稳定性、核酸（DNA）溶液稳定性、⽂库稳定性等进⾏了研究，确定了检测过程中各种样本类型的有效保存时间。
实时稳定性研究：采⽤三批次试剂盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）储存于-20±5℃条件下，分别在0、3⽉、6⽉和8⽉对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度
进⾏考察。结果显⽰，各项性能指标均符合要求，确定产品在-20±5℃条件下，可稳定保存6个⽉。
运输稳定性研究：采⽤三批试剂盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）按运输要求完成运输试验，然后按要求储存⾄效期末，在运输前/后、储存⾄效期末时分别对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进⾏考察。结果显⽰，各项性能指标均符合要求，确定了该产品的运输条件。
冻融稳定性研究：采⽤三批次试剂盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）反复冻融10次，分别在反复冻融第5次和10次后对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进⾏考察。结果显⽰，各项性能指标均符合要求。考虑到临床实际运⽤，为保证检测结果的准确性，建议冻融次数不超过5次。
开瓶稳定性研究：采⽤三批次试剂盒（P215090202Z、P215090603Z、P215100801Z）解冻后，拆开包装，将末端修复缓冲液、末端修复酶、连接缓冲液、连接增强⼦、接头、扩增反应缓冲液、LC-D5引物、LC-D7引物、封闭剂、捕获探针、杂交缓冲液、磁珠洗涤缓冲液、5×洗涤缓冲液、聚合酶、对照品等各组分震荡混匀、瞬时离⼼，在超净⼯作台中依次开盖后再盖紧，放置5分钟后置于-20±5℃存储（模拟使⽤过程），分别在第3和6个⽉对物理性能、准确度、特异性、检测限和精密度进⾏考察。结果显⽰，开瓶后的试剂盒在-20±5℃保存6个⽉，各项性能指标均满⾜要求。
申请⼈对⽯蜡包埋样本稳定性、核酸（DNA）样本冻融稳定性也进⾏了研究。研究确认⽯蜡组织样本保存期限不超过18个⽉；核酸（DNA）样本置于-20±5℃保存期限可达到8个⽉。三、临床评价摘要
临床试验在6家临床机构共同开展，共计完成有效样本2105例，包含1586例⾮⼩细胞肺癌样本（包括腺癌、鳞癌、腺鳞癌和⼤细胞癌等）、499例结直肠癌（包含左半结肠、右半结肠和直肠等）和20例⼲扰样本，样本类型为⽯蜡包埋组织。主要分为以下⼏部分：（⼀）⽐较研究
申请⼈在福建医科⼤学附属协和医院、第四军医⼤学附属唐都医院、福建省⽴医院、⾸都医科⼤学附属北京胸科医院共4家临床试验机构完成了临床试验。采⽤考核试剂与组织检测的⾦标准Sanger测序法对临床样本进⾏⽐较研究，验证本产品的临床性能。⼊组样本为⾮⼩细胞肺癌样本1248例、结直肠癌样本295例和⼲扰样本20例，共计1563例有效样本。样本类型均为⽯蜡包埋组织。考核试剂与对⽐试剂检测结果不⼀致的样本采⽤PCR⽅法进⾏验证。
本临床试验在1248例肺癌样本中共检出863例突变阳性样本，阳性率为69.15%。包括EGFR基因中335例L858R突变阳性、270例Exon19 deletion突变阳性、12例T790M突变阳性、14例L861Q突变阳性、6例S768I突变阳性、8例G719A突变阳性、9例G719S突变阳性；KRAS基因中33例G12D突变阳性、33例G12C 突变阳性、29例G12V突变阳性、7例G12A突变阳性、4例G12S 突变阳性、2例Q61H突变阳性；NRAS基因中G12D和Q61K突变阳性各1例；BRAF基因中13例V600E突变阳性；PIK3CA基因中17例H1047R突变阳性；MET基因中检出申报类型和⾮申报类型共20例MET Exon14 skipping阳性突变；HER2基因中24例A775_G776insYVMA突变阳性；ALK基因中检出申报类型和⾮申报类型共85例ALK基因重排（融合）阳性；ROS1基因中检出申报类型和⾮申报类型共13例ROS1基因重排（融合）阳性；RET基因中检出申报类型和⾮申报类型17例RET基因重排（融合）阳性。
与对⽐⽅法的研究结果显⽰，考核试剂的定性检测结果阳性符合率为98.99%（95%CI 98.02%～99.56%），阴性符合率为82.49%（95%CI 78.69%～85.87%），总符合率为92.95%（95%CI 91.38%～94.31%）。进⾏Kappa⼀致性检验，Kappa值=0.8429，P
＜0.001，显⽰⼆者具有良好的检测⼀致性。
在1248例肺癌样本中，两种⽅法检测结果不⼀致或不完全⼀致共有109例。109例样本的第三⽅验证结果中，有92例与考核试剂检测结果⼀致，有14例与对照⽅法检测结果⼀致，2例（双突变样本）与双⽅检测结果均不⼀致，1例因特殊情况未进⾏验证。
本临床试验在295例结直肠癌样本中共检出111例突变阳性样本，阳性率为37.63%。包括KRAS基因中45例G12D突变阳性、10例G12C突变阳性、17例G12V突变阳性、3例G12A突变阳性、3例G12S突变阳性；NRAS基因中8例G12D突变阳性、3例Q61K 突变阳性、2例Q61R突变阳性；BRAF基因中13例V600E突变阳性；PIK3CA基因中9例H1047R突变阳性；1例EGFR基因G719S 突变阳性；1例ROS1基因重排（融合）阳性。
与对⽐⽅法的研究结果显⽰，考核试剂的定性检测结果阳性符合率为100%（95%CI 96.38%～100%），阴性符合率为
94.36%（95%CI 90.13%～97.15%），总符合率为96.27%（95%CI 93.43%～98.12%）。进⾏Kappa⼀致性检验，Kappa值=0.9190，P ＜0.001，显⽰⼆者具有良好的检测⼀致性。
在295例结直肠癌样本中，两种⽅法检测结果不⼀致或不完全⼀致共有11例。11例样本的第三⽅验证结果中，有7例与考核试剂检测结果⼀致，有3例与对照⽅法检测结果⼀致，1例（双突变样本）与双⽅检测结果均不⼀致。（⼆）伴随诊断⽐较研究
申请⼈在⼭西省肿瘤医院进⾏考核试剂与伴随诊断⽤途试剂的⽐较研究。1.EGFR基因与已上市伴随诊断试剂盒的⽐较研究
EGFR基因突变对⽐试剂采⽤凯杰公司therascreen? EGFR RGQ PCR Kit试剂盒。本次对⽐研究共纳⼊220例福尔马林固定，⽯蜡包埋的晚期⾮⼩细胞肺癌组织样本。考核试剂在83例样本中检出阳性（其中19Del 41例、L858R 39例、T790M 3例、L861Q 3例、S768I 1例）。
考核试剂在220例样本中有6例样本定性检测结果与对照试剂不⼀致。其中5例为考核试剂检出阳性（其测序丰度均低于对照试剂检出限），对照试剂检出阴性。1例为考核试剂检出阴性，对照试剂检出阳性，可能原因为肿瘤组织异质性或检测⽅法学的差异。
考核试剂与对照试剂定性检测EGFR基因的阳性符合率为98.73%（95%CI 93.15%～99.97%），阴性符合率为
96.45%（95%CI 91.92%～98.84%），总符合率为97.27%（95%CI 94.16%～98.99%）。进⾏Kappa⼀致性检验，Kappa值=0.941，P＜0.001，
显⽰⼆者具有良好的检测⼀致性。
考核试剂与对照试剂定性检测19Del的阳性符合率为95.00%（95%CI：83.08%～99.39%），阴性符合率为
98.33%（95%CI：95.21%～99.65%），总符合率为97.73%（95%CI：94.78%～99.26%）；EGFR L858R检测结果的阳性符合率为94.74%（95%CI：82.25%～99.36%），阴性符合率为98.35%（95%CI：95.26%～99.66%），总符合率为97.73%（95%CI：94.78%～99.26%）；EGFR 稀有突变（包括T790M、L861Q、S768I 等）检测结果的阳性符合率为100.00%（95%CI：54.07%～100.00%），阴性符合率为100.00%（95%CI：98.29%～100.00%），总符合率为100.00%（95%CI：98.34%～100.00%）。2.ALK基因与已上市伴随诊断试剂盒的⽐较研究
ALK基因融合（重排）对⽐试剂采⽤雅培公司Vysis ALK Break Apart FISH 探针试剂盒和罗⽒公司VENTANA ALK免疫组化（IHC）检测试剂盒。本次对⽐研究共纳⼊228例福尔马林固定，⽯蜡包埋的晚期⾮⼩细胞肺癌组织样本。228例样本的FISH与IHC检测结果有4例不⼀致，224例⼀致。考核试剂在224例样本中共检出29例阳性。
考核试剂在224例样本中有2例样本检测结果与对照试剂不⼀致。1例为考核试剂检出阳性（其测序丰度较低），对照试剂
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